2011年执业药师考试药学专业知识(一)复习要点(11)
2012-02-20 08:49:32   来源：   评论：0 点击：

　　第六章 色谱法

　　l 色谱法：是一种物理或物理化学分离分析方法，将混合物中各组分分离后在线或离线分析的方法。是分析混合物的最有效的手段。

　　l 应用范围：定性鉴别、纯度检查、含量测定。

　　§1. 概论

　　★★一、基本原理

　　色谱过程是物质分子在相对运动的两相(固定相和流动相)间分配平衡的过程，可用分配系数(K )和容量因子(k)来描述。

　　混合物中，若两组分的 K或 k不等，则被流动相携带的速度不等，产生差速迁移，从而被分离。

　　1. 分配系数K：组分在固定相和流动相之间达到分配平衡时的浓度之比。

　　K = Cs/Cm

　　K：与组分自身特性、固定相、流动相的性质及温度有关

　　2. 容量因子k (质量分配系数)：达分配平衡后，组分在固定相和流动相中的质量之比。

　　k = Ws/Wm

　　k与K的关系： k = Cs·Vs/(Cm·Vm )= K(Vs/Vm)

　　k: 与组分、固定相、流动相的性质及温度有关;还与两相体积有关。

　　不同组分之间的 k 差异是色谱分离的先决条件

　　3. 色谱过程方程 tR=t0(1+K·VS/Vm)=t0(1+k)

　　二、分类：

　　《中国药典》将色谱法分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、电泳法

　　1. 按分离原理分类：

　　吸附色谱法：固定相为固体(吸附剂) 如GSC、LSC

　　分配色谱法：固定相为液体 如GLC、LLC

　　离子交换色谱法：固定相为离子交换树脂，适用于离子型的有机物或无机物的分离分析

　　分子排阻色谱法(空间排组色谱法、凝胶色谱法)：固定相为多孔性填料(凝胶)

　　2. 按操作形式分类：柱色谱法、平面色谱法、电泳法

　　§2. 薄层色谱法 thin layer chromatography TLC

　　一、基本原理：

　　分离依据：难被吸附化合物移动快，易被吸附化合物移动慢些，产生差速迁移®KA≠KB®分离

　　二、常用固定相

　　吸附TLC法的固定相为吸附剂，最常用硅胶，其次有硅藻土、氧化铝、微晶纤维素、聚酰胺。

　　1. 硅胶：SiO2·xH2O， 具有硅氧交联结构、表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是活性基团。含水量↑，活性↓。

　　活化：105℃ ~ 110℃加热30 min，吸附力增强。

　　TLC常用硅胶G、硅胶GF254、硅胶H和硅胶HF254。

　　2. 氧化铝：有碱性、中性和酸性三种

　　3. 聚酰胺：表面有酰胺基，与酚、羧酸、氨基酸等形成氢键

　　三、操作方法 薄层板的制备：涂布厚度0.2～0.3 mm。

　　点样与展开：点样的样点一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，样点直径为2～4mm。

　　一块板可以点多个样点，展开时，薄层板浸入展开剂的深度为距薄层底边0.5～1.0cm

(三)检视

　　荧光薄层板：荧光淬灭法

　　普通薄层板 有色 直接检视;无色 显色检视

　　通用型显色剂：碘、硫酸溶液、荧光黄溶液

　　(四)色谱系统适用性试验

　　目的： 使斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能符合规定

　　1.检测灵敏度

　　2.比移值(Rf)—— 基本定性参数 ： Rf = l / lo

　　Rf 最佳范围0.3～0.5;可用范围0.2～0.8。

　　3. 分离效能 分离度(R)表示 R=2d /(W1+W2)

　　★四、应用：TLC法主要用于药品的鉴别或杂质检查。

　　(一)鉴别：

　　将同浓度的供试品溶液、对照品溶液点在同一薄层板上¾®展开显色后¾®供试品、对照品颜色与比移值Rf均一致¾®可认为供试品与对照品是同一物质。

　　(1)与对照品比较Rf值 (2)与结构相似的物质比较Rf值

　　(二) 杂质检查

　　1. 杂质对照品法： 杂质斑点颜色与杂质对照品斑点比较，不得更深¾®可认为未超过规定的杂质最高限量。

　　2.自身稀释对照法(高低浓度对比法) 适用于得不到杂质对照品的情况

　　供试品溶液按限度规定稀释成另一低浓度溶液或系列溶液，为对照溶液。供试品杂质斑点与相应的自身稀释对照液所显主斑点比较，颜色不得更深

§3. 高效液相色谱法(HPLC)

　　high performance liquid chromatography HPLC

　　★一、基本原理

　　样品中各组分在固定相与流动相之间分配，由于各组分的分配系数不等，他们按分配系数大小的顺序依次被流动相带出色谱柱。K小的组分先流出，K大的组分后流出。

　　(一) 基本概念

　　1.色谱图和色谱峰

　　色谱图或流出曲线：色谱响应信号随时间的变化曲线

　　色谱峰：流出曲线上的突起部分。

　　正常：正态分布曲线;不正常：拖尾峰和前延峰。色谱峰正常与否用拖尾因子衡量。

　　每个组分的色谱峰可用三项参数说明

　　峰高或峰面积：用于定量。 峰宽W：用于衡量柱效

　　峰位：用保留值tR表示，用于定性。

　　2. 基线

　　在色谱分离过程中，没有组分流出时的流出曲线。反映色谱系统(主要是检测器)的噪音水平

　　3. 保留值

　　保留时间( tR )、死时间( t0 )、 调整保留时间(tR ´): tR ´= tR - t0

　　相对保留值(r)：即选择性因子， r2,1= tR2´/ tR1´= k2/k1

　　4. 色谱峰区域宽度 越小，流出组分越集中，有利于分离

　　标准差( )、半高峰宽( Wh/2)、峰宽(W)

　　★★(二) 塔板理论

　　色谱柱踏板数大于103时，流出曲线趋于正态分布。

　　理论踏板高(H)可由柱长(L)和理论踏板数 n 计算：

　　H = L /n n = 5.54 (tR/Wh/2)2

　　记录纸速(mm/min)：转换分子、分母单位相同的参数。联系时间单位与长度单位。

　　H 和 n 都是柱效指标，可用于评价柱效高低。 塔板数越多，塔板高度越小，柱效越高

　　例：用HPLC法测得某组分的保留时间tR为1.5 min，半峰宽Wh/2为0.2 cm;记录纸速为2.0 cm/min，则柱效为：

　　A. 1246

　　B. 2492

　　C. 623

　　D. 1800

　　E. 311

　　n=5.54(tR/ Wh/2)2 =5.54(1.5×2.0/0.2)2 =1246

(三) 速率理论 Van Deemter方程，范氏方程：H = A + B/u + Cu

　　A为涡流扩散项，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗项

　　HPLC中范式方程简化为： H = A + Cu

　　二、高效液相色谱仪

　　(一)仪器的基本结构

　　高压输液泵、色谱柱、进样阀、检测器

　　(二)检测器的类型和适用范围

　　1. 选择性检测器：也称浓度型检测器，包括紫外检测器、光二极管阵列检测器DAD、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器。

　　(1)紫外检测器：最常用。适于有共轭结构的化合物如芳香化合物、核酸及甾体激素等。

　　(2)光二极管阵列检测器 diode-array detector, DAD

　　(3)荧光检测器：仅适用于在流动相条件下具有荧光或经衍生转化为具有荧光的化合物

　　(4)电化学检测器： 仅适用于在流动相条件下可发生氧化-还原反应的化合物的检测。

　　(5)质谱检测器：主要应用于大分子物质的检测，如蛋白质、多肽等，以及色谱峰的纯度或原料药中的杂质检查。

　　2. 通用型检测器：也称质量型检测器，包括示差折光检测器和蒸发光散射检测器(ELSD)。

　　ELSD 仅适用于UV检测困难的物质的分析，如糖类和脂质等，以及药物杂质的确认。

　　三、液固吸附色谱法 LSC

　　l 分离原理：按被分离组分的分子(溶质分子)与流动相分子(溶剂分子)争夺吸附剂表面活性中心的吸附能力的差别而分离。

　　l 硅胶为吸附色谱法最常用的固定相。

　　四、液液分配色谱法 LLC

　　(一)正相分配色谱法：流动相极性<固定相极性。

　　主要用于分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。

　　反相分配色谱法：流动相极性>固定相极性。主要用于分离非极性至中等极性物质。

　　(二)LLC的固定相 最常用的固定相是化学健合相。

　　(1)非极性健合相：十八烷基硅烷健合硅胶(ODS，C18)、辛基硅烷健合硅胶(C8)，在反相HPLC中最为常用。

　　(2)极性健合相：常用氨基和氰基硅烷键合相，即可用于正相色谱法，也可用于反相色谱法。多用于正相HPLC。